Luận văn Nghiên cứu đặc tính hoá sinh dược, khả năng chống béo phì và rối loạn trao đổi chất của một số hợp chất tự nhiên từ dịch chiết quả Phật thủ (Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle (Noot))

I Mở đầu
1. Lý do chọn đề tài
Bệnh béo phì (obesity) được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) định nghĩa là tình trạng tích luỹ mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng tới sức khoẻ.
Người bị béo phì (BP) ngoài thân hình nặng nề, khó coi còn có nguy cơ mắc nhiều bệnh như rối loạn lipid máu, rối loạn về tim mạch, đột quỵ, tăng huyết áp, sỏi mật, đái tháo đường, xương khớp và ung thư trong đó biến chứng của bệnh tim mạch và đột quỵ là yếu tố gây tử vong hàng đầu.
Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khẳng định, BP là một đại dịch toàn cầu. Hiện nay số người BP trên Thế giới đã lên đến hơn 1,7 tỷ người. Trên Thế giới hiện nay, cứ bốn người trưởng thành thì có một người BP, tức là số người BP ở độ tuổi trưởng thành trên Thế giới chiếm 25% [1].
Tình trạng BP đang tăng lên với tốc độ báo động, không những ở các Quốc gia phát triển mà ở cả các Quốc gia đang phát triển. Tỉ lệ người BP ở Mỹ chiếm tới hơn 30%, Trung Quốc có hơn 20% số người thừa cân và béo phì (TCVBP). Số người béo phì cũng đang báo động ở châu Âu, đứng đầu bảng là nước Anh với hơn 23% số người BP, và châu Âu hiện có tới hơn 14 triệu trẻ em TCVBP. Còn ở châu Mỹ thì Braxin cũng là nước có tỉ lệ người dân bị béo phì cao (chiếm 16%) [1].
Theo tiêu chuẩn châu á, Việt Nam hiện nay có gần 17% số người trong độ tuổi 25 – 64 bị TCVBP, ở Thành phố, tỉ lệ này cao gấp 3 lần ở Nông thôn. Theo kết quả điều tra, các khu vực từ miền Nam trở vào có tỉ lệ TCVBP cao hơn phía Bắc, trong đó vùng Đông Nam bộ (bao gồm cả Thành phố Hồ Chí Minh) có tỉ lệ cao nhất (29,7%) và thấp nhất ở vùng Đông Bắc (9,5%). Tỉ lệ TCVBP gia tăng theo tuổi, trong đó 45 tuổi trở lên chiếm 2/3, trong khi theo điều tra trước đây, tỉ lệ này ở mức 5 – 6%. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, tỉ lệ thừa cân ở nam cao hơn ở nữ (40% so với 30%), nhưng tỉ lệ BP ở nam thì thấp hơn (24% ở nam so với 27% ở nữ). ở trẻ em, tình trạng BP cũng ở mức đáng ngại. Cũng theo kết quả điều tra của Viện Dinh dưỡng, có 4,9% số trẻ từ 4 – 6 tuổi tại Hà Nội bị TCVBP. ở Thành phố Hồ Chí Minh, tỉ lệ này còn cao hơn rất nhiều, có 6% trẻ dưới 5 tuổi và chiếm 22,7% trẻ đang học cấp một bị TCVBP. Đây thật sự là một mối đe doạ tiềm ẩn trong tương lai, ảnh hưởng lớn đến sức khoẻ của mỗi người và sự phát triển của kinh tế và xã hội. Điều đáng nói là trước những năm 1995 BP ở nước ta gần như không có, người thừa cân không đáng kể ở khu vực Thành phố thì từ năm 2005 đến nay TCVBP lại tăng nhanh chóng [1].
Do tốc độ phát triển nhanh của bệnh nên nhu cầu về thuốc điều trị cũng tăng nhanh. Ngày nay, hàng loạt thuốc điều trị bệnh BP đã ra đời và đang được sử dụng nhằm hạn chế sự phát triển của bệnh, tuy nhiên đây đều là những loại thuốc không rẻ và thường kéo theo nhiều phản ứng phụ cho cơ thể.
Uỷ ban chuyên gia của WHO đã khuyến nghị nên phát triển và sản xuất các thuốc có nguồn gốc thảo dược vì đây là nguồn dược liệu sẵn có, giá thành rẻ và ít độc.
Họ Cam chanh (Rutaceae) là họ khá phổ biến ở Việt Nam với số loài tương đối đa dạng. Hiện nay đã có một số công trình khoa học nghiên cứu về các loài trong họ này và cho kết quả khả quan về khả năng điều trị bệnh BP và tiểu đường. Tuy nhiên, chưa có tác giả nào đề cập đến đặc tính hoá sinh dược và tác dụng chống béo phì của quả Phật thủ (Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle (Noot)).
Xuất phát từ thực tế trên, cùng với mong muốn góp phần vào việc nghiên cứu, phát hiện thêm các thuốc có nguồn gốc thảo dược để dự phòng và chữa bệnh béo phì, chúng tôi chọn đề tài: 
“Nghiên cứu đặc tính hoá sinh dược, khả năng chống béo phì và rối loạn trao đổi chất của một số hợp chất tự nhiên từ dịch chiết quả Phật thủ (Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle (Noot))”
2. Mục đích nghiên cứu
Bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học cơ bản của quả Phật thủ (Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle (Noot)) và khả năng chống béo phì của một số phân đoạn dịch chiết trên mô hình chuột gây rối loạn trao đổi lipid và gluxit thực nghiệm. 
Dựa trên mục đích nghiên cứu như trên chúng tôi xác định một số nội dung công việc như sau:
Gây mô hình chuột béo phì thực nghiệm bằng thức ăn giầu chất béo.
Bước đầu nghiên cứu tác động của các phân đoạn dịch chiết từ quả Phật thủ lên trọng lượng cơ thể và một số chỉ số hoá sinh (Glucose, Cholesterol, Triglycerid, HDL, LDL, Lipase) của chuột béo phì thực nghiệm.
Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết từ quả Phật thủ lên chỉ số glucose máu của chuột béo phì được tiêm STZ liều thấp (110 120mg STZ/kg).
3. Đối tượng nghiên cứu
3.1. Mẫu thực vật
- Quả Phật thủ (Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle (Noot)).
- Thời gian thu hái: được thu mua ngoài chợ vào tháng 6-7/ 2009.
- Xử lí mẫu: Quả tươi được thái mỏng và bảo quản trong dung dịch ethanol 95%. Tên khoa học được xác định theo Tiến sĩ phân loại thực vật Võ Văn Chi.
3.2. Mẫu động vật 
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss (14 – 15g) 4 tuần tuổi được mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ TW.
- Thức ăn tiêu chuẩn được mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ TW.
- Thức ăn giàu lipid được trộn từ nhiều thành phần khác nhau như: Ngô, Đậu tương, sữa bột nguyên kem, lạc, lòng đỏ trứng, mỡ lợn
3.3. Mẫu vi sinh vật
- Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922)
 Pseudomonas aeraginosa
- Gr (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212)
 Staphylococcus aureus
4. Phương pháp nghiên cứu
4.1. Khảo sát sơ bộ thành phần hoá học của cây Phật thủ
4.1.1. Định tính một số hợp chất tự nhiên trong quả Phật thủ 
- Định tính flavonoids.
- Định tính tannins.
- Định tính các polyphenols khác.
- Định tính alkaloids.
4.1.2. Định lượng hợp chất phenolics tổng số theo phương pháp Folin –Ciocalteau.
4.1.3. Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên bằng sắc ký lớp mỏng.
4.2. Nghiên cứu tác dụng chống béo phì và hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết từ quả Phật thủ
4.2.1. Thử độc tính theo đường uống, xác định LD50.
4.2.2. Nghiên cứu tác dụng chống béo phì của các phân đoạn dịch chiết
4.2.2.1. Mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss (khối lượng ban đầu là 14 – 15g) được chia làm nhiều lô, mỗi lô gồm 6 con.
- Lô nuôi thường: Cho ăn chế độ bình thường (thức ăn chuẩn của Viện Vệ sinh Dịch tễ TW).
- Các lô còn lại: Cho ăn thức ăn giàu lipid với thành phần được trộn từ nhiều loại thức ăn khác nhau như: ngô, sữa bột, lòng đỏ trứng, lạc, mỡ nước
- Thời gian nuôi chuột theo hai chế độ ăn là 6 tuần.
- Thời gian điều trị thử nghiệm cao dịch chiết 3 tuần.
Bảng 1. Thành phần thức ăn giàu lipid
Thành phần
Tỉ lệ %
Hydratcacbon
41
Lipid
32
Protein
20
Cholesterol
1
Chất khoáng
4
Vitamin và axit amin
2
Thành phần thức ăn được tính toán dựa trên thành phần dưỡng chất của từng loại hỗn hợp thức ăn phối trộn, theo tài liệu chuẩn của Viện Dinh dưỡng Quốc gia Việt Nam.
Sau 6 tuần nuôi, tiến hành cân đo trọng lượng và xét nghiệm một số chỉ số hoá sinh (Glucose, Cholesterol, Triglycerid, HDL, LDL, Lipase) để xác định mức độ khác nhau của các lô theo hai chế độ ăn.
4.2.2.2. ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến một số chỉ số hoá sinh trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm (thời gian điều trị 3 tuần).
Chuột sau khi nuôi bằng mô hình gây béo phì thực nghiệm, chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm tiếp. Chuột béo phì được chia làm nhiều lô, mỗi lô gồm 6 con, cao của các phân đoạn dịch chiết từ quả Phật thủ được hoà vào nước rồi cho chuột uống hàng ngày vào buổi sáng:
- Lô 1: Chuột béo phì không điều trị, chỉ cho uống nước muối sinh lý (0,9% NaCl), (lô đối chứng).
- Lô 2: Chuột béo phì cho uống cao phân đoạn ethanol (80%) (khoảng 1000 2000 mg chất khô của cặn cao).
- Lô 3: Chuột béo phì cho uống cao phân đoạn n – hexan (khoảng 1000 2000 mg chất khô của cặn cao).
- Lô 4: Chuột béo phì cho uống cao phân đoạn ethyaxetat (khoảng 1000 2000 mg chất khô của cặn cao).
- Lô 5: Chuột béo phì cho uống Metformin (Merk) – một loại thuốc chữa béo phì, tiểu đường type 2 hiện đang bán trên thị trường với liều 500mg/kg thể trọng.
Thời gian điều trị chuột là 21 ngày (3 tuần).
Sau 21 ngày cho uống các phân đoạn dịch chiết, chúng tôi tiến hành xác định trọng lượng và lấy máu chuột để phân tích một số chỉ số hoá sinh: Glucose, Cholesterol, Triglycerid, HDL, LDL, Lipase.
4.2.3. Phương pháp gây rối loạn trao đổi glucose máu của chuột béo phì thực nghiệm bằng STZ liều thấp
Chuột được nuôi bằng mô hình béo phì thực nghiệm. Trước khi thí nghiệm cho chuột nhịn đói 16h, tiêm màng bụng streptozotocin gây rối loạn trao đổi glucose máu của chuột béo phì thực nghiệm nhằm tạo mô hình đái tháo đường type 2 phát triển từ béo phì. Sau đó chuột được tiếp nhận thức ăn bình thường. Sau một thời gian khoảng vài ngày tiến hành phân lô để nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của phân đoạn dịch chiết từ quả Phật thủ.
Lô STZ nhóm đối chứng cho uống nước cất.
Lô STZ điều trị bằng phân đoạn ethanol (80%).
Lô STZ điều trị bằng Metformin (500mg/kg).
Sau khi cho chuột uống phân đoạn dịch chiết ethanol thì tiến hành đo nồng độ glucose máu của chuột tại các thời điểm 2 giờ, 4 giờ, 8 giờ và 10 giờ. Sau đó tiếp tục điều trị cho chuột trong 21 ngày.
 5. Dự kiến đóng góp mới
Phát hiện ra một vài phân đoạn dịch chiết của quả Phật thủ có khả năng chống béo phì và rối loạn trao đổi chất trên cơ sở mô hình chuột thí nghiệm.
Rút ra kết luận khoa học về khả năng chống béo phì và rối loạn trao đổi chất của dịch chiết từ quả Phật thủ.
Sản phẩm nghiên cứu là luận văn thạc sĩ và một công bố khoa học trên tạp chí chuyên ngành.
II. Nội dung
1. Dự kiến cấu trúc luận văn
Mở đầu
1. Lý do chọn đề tài.
2. Mục đích nghiên cứu.
3. Giới hạn nghiên cứu.
Nội dung
Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Các hợp chất thực vật thứ sinh.
1.2. Bệnh béo phì.
1.3. Bệnh đái tháo đường.
1.4. Vài nét về cây Phật thủ (Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle (Noot)).
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu.
2.1. Đối tượng nghiên cứu.
2.2. Phương pháp nghiên cứu.
Chương 3. Kết quả và thảo luận.
3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ quả Phật thủ.
3.2. Định tính một số hợp chất tự nhiên trong các dịch chiết của quả Phật thủ.
3.3. Định lượng phenolics tổng số trong các phân đoạn dịch chiết.
3.4. Phân tích các thành phần hợp chất tự nhiên từ quả Phật thủ bằng sắc kí lớp mỏng.
3.5. Kết quả thử độc tính cấp LD50 theo đường uống.
3.6. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ quả Phật thủ lên chuột béo phì thực nghiệm được điều trị trong 3 tuần (21 ngày).
3.6.1. Kết quả gây mô hình chuột béo phì thực nghiệm.
3.6.2. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết lên trọng lượng của chuột béo phì thực nghiệm (điều trị trong 3 tuần).
3.6.3. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết tới một số chỉ số hoá sinh liên quan đến rối loạn trao đổi lipid và gluxit (điều trị trong 3 tuần).
3.7. Tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết quả Phật thủ trên chuột tiêm STZ.
3.7.1. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết lên chuột tiêm STZ sau 10h điều trị.
3.7.2. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết lên chuột đái tháo đường do tiêm STZ sau 21 ngày điều trị.
Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
2. Dự kiến thời gian thực hiện luận văn
- Tháng 6/2009: Nhận đề tài và đọc tài liệu liên quan.
- Tháng 7/2009: Thu thập mẫu quả Phật thủ (Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle (Noot)).
- Tháng 8/2009 đến tháng 11/2009: Làm việc trong phòng thí nghiệm (Chiết, cao cồn và tạo các phân đoạn dịch chiết).
- Tháng 10/2009: Lập đề cương nghiên cứu và chuẩn bị bảo vệ đề cương.
- Tháng 11/2009: Bảo vệ đề cương tại trường ĐHSP Hà Nội 2.
- Tháng 11/2009 đến tháng 3/2010: Nuôi chuột trong phòng thí nghiệm. Lấy mẫu máu và phân tích các chỉ số hoá sinh máu trước và sau khi cho uống các phân đoạn dịch chiết.
- Tháng 3/2010 đến tháng 8/2010: Xử lý số liệu, viết và chỉnh sửa nội dung luận văn dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Đỗ Ngọc Liên.
- Tháng 9/2010: Nộp luận văn về Phòng Sau Đại Học trường ĐHSP Hà Nội 2.
- Tháng 11/2010: Bảo vệ luận văn.
3. Dự kiến tài chính thực hiện luận văn
- Kinh phí tự túc song có sự hỗ trợ của nhà trường nơi đào tạo (Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2).
- Sự hỗ trợ của thầy hướng dẫn về một số hoá chất và trang thiết bị máy móc cần thiết cho việc làm thí nghiệm.
4. Dự kiến người hướng dẫn và tư vấn trong quá trình thực hiện luận văn
- Hướng dẫn chính: GS.TS. Đỗ Ngọc Liên.
- Cùng tập thể các anh chị em có kinh nghiệm về thao tác trong phòng thí nghiệm và thực tế nuôi chuột.
III. Kết luận
1. Dự kiến kết quả nghiên cứu
Có kết luận sơ bộ về thành phần hoá học trong dịch chiết tự nhiên từ quả Phật thủ (Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle (Noot)).
Dự kiến phát hiện ra một số phân đoạn dịch chiết của quả Phật thủ có khả năng chống béo phì và rối loạn trao đổi chất của cơ thể.
Sản phẩm nghiên cứu là luận văn thạc sĩ khoa học.
Có một công bố khoa học trên tạp chí khoa học trong nước.
2. Kiến nghị
Đối với trường ĐH SPHN 2 và trường ĐH KHTN: 
Tạo điều kiện về hoá chất và thiết bị thí nghiệm.
IV. Tài liệu tham khảo
Tạ Văn Bình (2007), Những nguyên lý nền tảng – tăng glucose máu, NXB Y học, Hà Nội.
Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội.
Trương Văn Châu, Trần Hồng Quang, Đỗ Ngọc Liên (2006), “Đặc tính kháng khuẩn của các hợp chất phenolic ở một số loài cây thuộc chi Garcinia. L.”, tạp chí Sinh học 26(4), Tr. 59 – 62.
Đỗ Hùng Cường (2009), Nghiên cứu tách chiết một số hợp chất tự nhiên từ quả dọc (Garcinia Multiflora) có tác dụng chống béo phì và rối loạn trao đổi chất. Luận văn thạc sỹ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Hoàng Thị Hương Quỳnh (2008), Nghiên cứu tách chiết và đặc tính sinh dược học của một số hợp chất tự nhiên từ cây hồng bì (Clausena lansium L.). Đề cương luận văn thạc sỹ, Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
Viện Dược Liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
Cannell R. J. P (1989), Natural Products Isolation, Humana Press, pp. 354.
Hayerman A. E., Bulter I. G. (1994), “Assay of condensed tannins or flavonoid oligomers and related flavonoid in plant” Meth, Enz, Vol. 234, pp. 249.
Lorke D. A. (1983), “A new approach to practical acute toxicity testing”, Arch Toxicol, Vol. 54, pp. 275 - 287.
Orthofer . V. L., Lamuela – Raventos R. M. (1999), “Analysis of total phenols and ather oxidation substrate and antioxidants by means of Folin – Ciocalteu Reagent”, Method in Enzymology, 299, pp. 152 – 178.
Swain J., Goldstein J. L. (1963), “Method in polyphenol chemistry” Proceedings of the plant phenolic group symposium, Oxford, pp. 131.